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禽流感病毒H7N9亚型荧光定量RT(2)

2020-02-14 23:39栏目:主页 > 365bet >

摘要:单反液配制表(每份) RT-PCR反应液 15.0 μL 逆转录酶 2.0 μL Taq酶 3.0 μL (3)在无菌离心管中参与上述试剂,充沛混匀后瞬时离心。依照20 μL/管分装量将试剂分装......

  单反液配制表(每份)

  RT-PCR反应液

  15.0 μL

  逆转录酶

  2.0 μL

  Taq酶

  3.0 μL

  (3)在无菌离心管中参与上述试剂,充沛混匀后瞬时离心。依照20 μL/管分装量将试剂分装至PCR反应管。

  2.样本准备(样本处理区)

  用QIAGEN、Roche公司RNA提取试剂盒提取RNA,具体操作依照其试剂盒说明书操作。

  3.加样

  在上述制备好的PCR反应样本管中辨别参与处理好的待测标本RNA各5 μl、终体积25 μl/管,盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心,转移到PCR仪器 上。阴性对比和阳性对看管则各加5 μL试剂盒自带的阴性对比或阳性对比品,终体积为25 μl/管,盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心,转移到PCR仪器 上。

  4. PCR(PCR扩增区)

  (1)取样本处理区准备好的PCR反应管,放置在及时荧光定量PCR仪样品槽响应位置,并记录放置依次。

  (2)按下表设置仪器 核酸扩增相干参数停止PCR扩增。

  禽流感病毒H7N9亚型荧光定量RT-PCR试剂盒应用方法

  反应体积

  25 μL

  通道选择

  FAM通道收集病毒荧光旌旗灯号

  PCR

  反应

  条件

  步调

  条件

  轮回数

  反转录

  42℃:10分钟(min)

  1

  预变性

  95℃:3分钟(min)

  1

  预扩增

  95℃:5秒(s)

  5

  55℃:40秒(s)

  PCR扩增

  95℃:5秒(s)

  40

  55℃:40秒(s)

  (此阶段完毕时收集荧光旌旗灯号)

  注:ABI系列荧光PCR仪在设置时不选ROX校订,设置淬灭基团选择None。

  实用范围【参考值】

  1.试剂盒有效性判定:

  (1)阳性对比:有典范S型扩增曲线或Ct值≤35。

  (2)阴性对比:Ct值>38或无Ct值,线形为直线或细微斜线,无指数增临时。

  2.标本结武判定:

  (1)阳性:标本检测结果Ct值≤35或有清晰指数增临时。

  (2)可疑:标本检测结果Ct值在35~38范围内。此时应对标本停止重复检测,如重复试验结果Ct值仍在35~38范围内,有清晰指数增临时,则判定为阳性,否则为阴性。

  (3)阴性:标本检测结果Ct值>38或无Ct值。

  测试申报【考验结果的说明】

  通道及检测结果

  标本检测结果说明

  FAM

  阳性(+)


        
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